Βρείτε μας στο Google News. Πατήστε εδώ!Ο καθηγητής Shimpei Gotoh και ο κατώτερος αναπληρωτής καθηγητής Kazuo Takayama συνεργάστηκαν στη μελέτη για να κατασκευάσουν ένα νέο σύστημα καλλιέργειας in vitro για κυψελιδικά και επιθηλιακά κύτταρα αεραγωγών, χρησιμοποιώντας μια μέθοδο μηχανικής βιοϋλικών γνωστή ως τεχνική μικρο-μοτίβου και χρησιμοποιώντας το πρόσφατα επινοημένο σύστημα για την προσομοίωση ιογενών λοιμώξεων από παραλλαγές SARS-CoV-2. Η μελέτη δημοσιεύεται στο περιοδικό Stem Cell Reports.
Το αναπνευστικό επιθήλιο που καλύπτει τον αεραγωγό και τις κυψελίδες, όπου λαμβάνει χώρα ανταλλαγή οξυγόνου και διοξειδίου του άνθρακα, αποτελείται κυρίως από δύο τύπους κυττάρων, κυψελιδικά επιθηλιακά κύτταρα τύπου 1 και 2, που αναφέρονται ως AT1 και AT2, αντίστοιχα. Ενώ τα κύτταρα ΑΤ1 είναι λεπτά και επίπεδα, βέλτιστα για τη μεσολάβηση της ανταλλαγής αερίων, τα κυβοειδή κύτταρα ΑΤ2 εκκρίνουν επιφανειοδραστικές πρωτεΐνες και λειτουργούν ως βλαστοκύτταρα ιστού.
Με τις ικανότητές τους για αυτοανανέωση και διαφοροποίηση ΑΤ1, τα κύτταρα ΑΤ2 παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον στην αναγεννητική ιατρική για τη διευκόλυνση της αποκατάστασης τραυματισμένων ή νοσούντων πνευμόνων. Το εργαστήριο Gotoh έχει προηγουμένως επινοήσει ένα πρωτόκολλο για τη χρήση κυψελών iPS ως πολύτιμου υλικού εκκίνησης για τη δημιουργία κυψελών AT2.
Ωστόσο, η απαίτηση για τρισδιάστατη καλλιέργεια με βάση το Matrigel περιορίζει το μέγεθος της καλλιέργειας και την άμεση ανάλυση βάσει εικόνας. Επιπλέον, τα κύτταρα σε τέτοια συστήματα τυπικά προσανατολίζονται με την κορυφαία τους επιφάνεια στραμμένη προς τα μέσα, επομένως δεν μπορούν να μοντελοποιήσουν με ακρίβεια τη δομή ιστού in vivo για μηχανιστικές μελέτες.
Σε μια προσπάθεια να δημιουργηθεί ένα καλύτερο μέσο για τη διαφοροποίηση και την ανάπτυξη κυττάρων AT2 που προέρχονται από κύτταρα iPS, μη αυτοκόλλητες πλάκες κυτταροκαλλιέργειας 2,5 διαστάσεων (D) διαμορφώθηκαν με μικρομοτίβα με μικροσκοπικούς κύκλους κυτταρικής συγκολλητικής επικάλυψης, διαμέτρου 100 ή 200 μm. (για σύγκριση, η διάμετρος της ανθρώπινης τρίχας κυμαίνεται από 17-181 μm).
Πρώτον, για να εξασφαλιστεί ότι τέτοιες πλάκες με μικρομοτίβα είναι συμβατές με την επαγωγή κυττάρων ΑΤ2, προγονικά κύτταρα πνεύμονα που προέρχονται από κύτταρα iPS που εκφράζουν μια πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη κατά τη διαφοροποίηση σε κύτταρα ΑΤ2 σπάρθηκαν και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένα μέσο καλλιέργειας ειδικά για επαγωγή κυψελιδικών επιθηλιακών κυττάρων.
Σε σύγκριση με τις συμβατικές καλλιέργειες μονοστιβάδας 2D, η σχετική αναλογία φθοριζόντων κυττάρων και η έκφραση του SFTPC, ενός γονιδίου που κωδικοποιεί μία από πολλές επιφανειοδραστικές πρωτεΐνες, ήταν σημαντικά υψηλότερες στο σύστημα με μικρο-μοτίβο από ό,τι στις συμβατικές καλλιέργειες. Αξίζει να σημειωθεί ότι η πρωτεΐνη NaPi2b παρατηρήθηκε στην άκρη των αποικιών που σχηματίστηκαν στην κυτταρική συγκολλητική επίστρωση με μικρο-μοτίβο, ενδεικτικό ενός προσανατολισμού “κορυφής προς τα έξω” για αυτά τα κύτταρα ΑΤ2.
Κατά τη διάρκεια αυτής της μελέτης, οι ερευνητές παρατήρησαν ότι μια φθορίζουσα χρωστική που δεσμεύει το DNA (Hoechst-33342) χρωματίζει τα περιφερειακά ζωντανά κύτταρα πολύ πιο γρήγορα από αυτά στο κέντρο. Διαχωρίζοντας τα κύτταρα με βάση την ένταση φθορισμού τους, βρήκαν περισσότερα κύτταρα με πράσινο φθορισμό και γονίδια δεικτών AT2 να εμπλουτίζονται στον υποπληθυσμό άκρων (Hoechst-33342high) σε σύγκριση με τον υποπληθυσμό του κέντρου (Hoechst-33342low), γεγονός που υποδεικνύει περαιτέρω το AT2 την περιφέρεια.
Στη συνέχεια, η ερευνητική ομάδα διαχώρισε τα ακραία και τα κεντρικά κύτταρα και ανέλυσε τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης τους με αλληλούχιση χύδην RNA (RNA-seq). Μεταξύ σχεδόν 2.000 διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων, αρκετά γονίδια δείκτη AT2 και ενδογενή κατασταλτικά γονίδια WNT ρυθμίστηκαν σημαντικά προς τα πάνω στον περιφερειακό υποπληθυσμό σε σύγκριση με τα αδιαφοροποίητα προγονικά κύτταρα του πνεύμονα, ενδεικτικό της κατασταλμένης σηματοδότησης WNT σε κύτταρα AT2 στην περιφέρεια. Αντίθετα, το προφίλ γονιδιακής έκφρασης πρότεινε ενεργοποίηση σηματοδότησης Notch στον υποπληθυσμό πυρήνα.
Στη συνέχεια, για να αποδειχθεί ότι αυτό το σύστημα με μικρομοτίβα μπορεί να δημιουργήσει επιθηλιακά κύτταρα πολλαπλών αεραγωγών, τα προγονικά κύτταρα του πνεύμονα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένα μέσο για την προώθηση της διαφοροποίησης προς το ώριμο επιθήλιο των αεραγωγών. Ως αποτέλεσμα, η γονιδιακή έκφραση, ο ανοσοφθορισμός και οι ηλεκτρονικές μικροσκοπικές αναλύσεις ανίχνευσαν την ανοδική ρύθμιση των γονιδίων δεικτών πολυπυρηνικών κυττάρων (FOXJ1 και SNTN) και των πρωτεϊνών (FOXJ1 και ακετυλιωμένη τουμπουλίνη), καθώς και κινούμενες βλεφαρίδες σε πολυπυρηνικά κύτταρα.
Επιπλέον, το σύστημα με μικρομοτίβα ήταν πιο αποτελεσματικό στη δημιουργία κυττάρων FOXJ1+ από τις συμβατικές καλλιέργειες 2D. Με το μαζικό RNA-seq, οι ερευνητές διέκριναν ότι τα γονίδια που σχετίζονται με κύλικες και βλεννώδεις κυτταρικές σειρές ήταν ομοίως ρυθμισμένα προς τα πάνω τόσο στους ακραίους όσο και στους κεντρικούς υποπληθυσμούς σε σύγκριση με τα προγονικά κύτταρα του πνεύμονα, με τον κεντρικό υποπληθυσμό να δείχνει επίσης ανοδική ρύθμιση αρκετών γονιδίων δεικτών που σχετίζονται με πολλαπλά κύτταρα. εκτός από τον εμπλουτισμό των όρων πολλαπλής γονιδιακής οντολογίας (GO) με τα διαφορικά ρυθμιζόμενα γονίδια του.
Οι ερευνητές ανέλυσαν επίσης τους διάφορους τύπους κυττάρων στις αποικίες με μικρο-μοτίβο με μονοκύτταρα (sc)RNA-seq που επάγεται και στους δύο τύπους επιθηλιακών κυττάρων. Τα κυψελιδικά επιθηλιακά κύτταρα διαχωρίστηκαν κυρίως σε τρεις ομάδες: κύτταρα ΑΤ2 που χαρακτηρίζονται από υψηλή έκφραση γονιδίων δεικτών ΑΤ2, πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα ΑΤ2 με χαμηλή έκφραση δείκτη και αναπνευστικά κύτταρα που μοιάζουν με βρογχιόλια.
